大连胃肠肿瘤的微环境-大连春柳胃肠医院

大连胃肠肿瘤的微环境

来源:大连春柳胃肠医院时间：2022-09-20 01:30

胃肠肿瘤的微环境

在过去的十年中，胃肠肿瘤的微环境已越来越引起人们的关注，因为它是肿瘤发生、发展和转移所必需的。肿瘤微环境由多种成分组成，并且已被公认为是上皮癌的主要标志之一。尽管之前胃肠肿瘤的治疗策略着眼于上皮细胞的间质部分，但基于以往报道的有关胃肠肿瘤发展过程中胃肠上皮细胞、基质细胞及免疫细胞之间的相互作用，人们的兴趣越来越多地集中在那些改变微环境的反应物。我们对胃肠道肿瘤微环境中的不同细胞成分及其在肿瘤发生中的作用进行回顾，并讨论如何提高对这种复杂基质网络的理解，以期制定新的治疗策略。

在全球范围内，消化系癌症是一个重大的医疗负担。据估计，美国2008 年至少有270 000 例患者被诊断为消化系癌症，并且至少135 000 例患者死于消化系癌症[1]。关于胃肠（gastrointestinal，GI）癌症患者的研究和治疗策略多着眼于上皮成分的细胞自治机制。然而大量的体内证据表明，上皮细胞可对其微环境产生应答，这其中包括间充质细胞、免疫细胞、肠神经系统以及基质。肠腔内容物，特别是微生物，是这个复杂网络中的另一重要特征；其对免疫及肿瘤发生的影响才刚开始被了解[2]。

许多消化系肿瘤源自慢性炎症（图1A），包括食管腺癌（源自Barrett 食管）、胃癌（源自幽门螺杆菌相关性胃炎）、肝细胞癌（源自病毒性肝炎）、结肠癌（源自炎性肠病），甚至可能包括胰腺癌（源自慢性胰腺炎）[3]。此外，根除感染源（如幽门螺杆菌）和抗炎疗法（如前列腺素合成酶抑制剂或美沙拉嗪）都可预防癌症[4,5]。慢性炎症介导的肿瘤形成很有可能被免疫细胞及其产生的细胞因子所调节，这些细胞因子可改变微环境以促进肿瘤形成及进展[6]。重要的是，散发性肿瘤尽管并非慢性炎症的直接结果，仍具有炎症微环境的显著特征。

并不是所有的肿瘤相关性炎症都会导致肿瘤的发生，获得性免疫应答在免疫监视和肿瘤抑制方面发挥着有效作用[7]。然而，无论是重度的还是轻度的炎症，都往往会刺激而非防止肿瘤的发生。细胞因子和生长因子可促进肿瘤细胞增殖、抑制细胞凋亡、抑制抗肿瘤免疫；基质金属蛋白酶（matrix metalloprotease，MMP）和血管生成因子则有助于肿瘤侵袭、转移以及肿瘤血管的形成。因此，已发生改变的上皮细胞可改变其周围的基质，连同介质一起最终创造出肿瘤发生微环境。为了建立更好的监控策略和治疗方法，了解各种基质细胞在肿瘤微环境中的功能及作用显得尤为重要。

肿瘤微环境中的细胞类型

虽然现在尚不清楚炎症是先于肿瘤发生还是由其激活，但胃肠肿瘤的基质常被一系列具有基质扩增功能的骨髓来源细胞所浸润（图1B）。炎症环境包含固有免疫系统细胞如肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophage，TAM）、中性粒细胞、髓源性抑制细胞（myeloid-derived suppressor cell，MDSC）或者不成熟中幼粒细胞（immature myeloid cell，iMC）、肥大细胞（mast cell，MC）和树突状细胞（dendriticcell，DC），同时也包括了获得性免疫系统细胞，如T 细胞和B 细胞[8]（图1B）。

肿瘤基质中免疫细胞的复杂网络几乎影响肿瘤生物学的各个方面。固有与获得性免疫细胞都可以促进肿瘤发生。固有免疫细胞，如TAM、MC、中性粒细胞和MDSC，促进肿瘤的发展，而获得性免疫细胞亚群，如辅助性T 细胞（T-helper，Th）17 和Th2，也可以加重炎症而促进肿瘤发生。这些细胞的致瘤特性需要细胞因子、生长因子、酶和血管生成调节因子等产物。免疫细胞招募至肿瘤中不仅促进肿瘤增殖和侵袭，而且也是抗肿瘤免疫应答所必需的。

结肠肿瘤中T 细胞的密度和位置与患者的预后相关，与组织学TNM分级相比，它们可能是更好的预后因素[9,10]。对于结肠癌甚至肝脏转移的患者，肿瘤中心和外侵边缘高密度的细胞毒性和记忆性T细胞与疾病复发减少相关，是良好的预后因素[9]。此外，肿瘤转移灶中免疫浸润的成分与患者对治疗的反应相关[11]。

图1（ A）炎症诱导肿瘤发生的不同细胞机制。外部和宿主因素可以创建一个诱导DNA 损伤导致基因改变的慢性损伤的炎性肠环境。癌变过程中，不同的髓系细胞、T 细胞和CAF（图2）被招募至炎症部位创建一个微环境，导致促癌和抑瘤因子的失衡，进而促进上皮细胞增殖并防止细胞凋亡。多种细胞因子和趋化因子构成的网络产生的壁龛，能够促使肿瘤启动细胞产生，并促进其生长。

图一（B）被招募的（髓细胞、T 细胞、CAF）或在肿瘤微环境中固有的（CAF、内皮细胞、神经）细胞类型及其对肿瘤的促进或抑制作用。这些细胞类型之间构成的复杂信号网络促进胃肠上皮从正常到化生，再到不典型异型增生（癌变）的进展。

以上发现激发了一种想法，通过“免疫评分“来量化肿瘤内部细胞毒性和记忆性T 细胞的部位和密度。由于其强大的预后价值，免疫评分被提议纳入肿瘤患者的常规诊断及预后评估[12]。此外，免疫疗法可能在干扰肿瘤诱导的免疫抑制和诱导抗肿瘤免疫应答方面取得进展[13]。到目前为止，T 细胞亚群差异聚集的确切机理仍不十分清楚，然而阐明获得性T 细胞应答的调节具有巨大的治疗潜力。

TAM 是一群修饰后异构免疫细胞，其在肿瘤内的大量聚集预示预后较差[14]。相应地，Apc △ 716 小鼠中巨噬细胞的减少可降低肠息肉发病[15]。与Th1 和Th2 型T 细胞类似，巨噬细胞在体外可分为经典活化M1 或替代性活化M2 型巨噬细胞。

M1 型巨噬细胞由干扰素（interferon，IFN）-γ和微生物产物所诱导，可产生高水平的炎性细胞因子，表达主要组织相容性复合物Ⅱ类分子，也具有细胞毒活性[8]。M2 型巨噬细胞表达高水平的免疫抑制性细胞因子白细胞介素（interleukin，IL）-10，减少抗原呈递，具有瘤体破坏活性，但与M1 型巨噬细胞相比，M2 型巨噬细胞可提高组织重塑能力。

巨噬细胞在实体瘤中的大量聚集，已被公认为具有致瘤性的M2 表型，并几乎涉及肿瘤生物学的每个方面[16]。已证实，不同分期结直肠癌（colorectal cancer，CRC）中M1 型巨噬细胞的浸润与较好的预后相关，但也同时伴有M2 型巨噬细胞的增多[17]。

然而，GI 肿瘤中TAM 的细胞因子有部分重叠，因此在体内无法区分M1 和M2 型巨噬细胞。因此，将巨噬细胞分为抗肿瘤发生的M1 和促肿瘤发生的M2 是对体内巨噬细胞群真实表型多样性的过度简化。MDSC 是在荷瘤小鼠和癌症患者体内扩散的一组CD11b+Gr-1+（Ly6G-Ly6Chigh）的异质性活化iMC 亚群[18]。iMC 可在骨髓中被检测到，偶尔在无癌动物的脾脏中也可以被检测到[19]，但大量存在于慢性炎症和致癌反应动物的脾脏中。

在致癌作用下，iMC 获得抑制性能，成为MDSC[20]。尤其是在炎症诱导的胃和食管癌的模型中，MDSC 可能介导致癌作用[21,22]。在肿瘤微环境中，MDSC通过干扰T 细胞功能和促进免疫抑制性调节性T 细胞（Tregulatory，Treg）的分化而起到抑制抗肿瘤免疫的作用[23]。

图2 肿瘤起始细胞或CSC的壁龛可能是由肿瘤微环境中能产生致瘤性细胞因子和趋化因子的不同类型的细胞形成的。它们创造的增殖环境使肿瘤启始细胞尽管发生遗传改变仍能逃避凋亡得以增殖。壁龛内的细胞可以改变上皮细胞的表观遗传调控及其信号通路。此外，上皮细胞管腔侧的微生物也有助于改变细胞壁龛、形成屏障缺陷和维持慢性炎症。肿瘤微环境的所有成分均可能是被上皮细胞的信号所调节。

除了较为熟知的抑制细胞毒性T 细胞的作用外，MDSC 也可以直接促进肿瘤的进展和转移。Cis-Apc/Smad4 小鼠侵袭性结肠肿瘤中发现了严重的髓细胞浸润，尤其是在侵袭前缘。招募至cis-Apc/Smad4 肿瘤的iMC 产生MMP-2 和MMP-9，可降解细胞外基质和胶原蛋白Ⅳ。这些酶促进肿瘤细胞的侵袭[24]。敲除p120- 联蛋白（p120-catenin，p120ctn）的小鼠发生食管鳞状细胞癌，异型增生上皮的细胞因子上调会促进MDSC 的动员和招募，从而形成促进肿瘤形成的微环境[25]。

小鼠和人的肠息肉和结直肠肿瘤中MC 数量增加，这可能会促进肿瘤生长[26,27]。通过骨髓移植消耗Apc △ 468 小鼠的MC 可减少息肉形成的数量和血管密度[26]。然而迄今为止，对MC 的功能分析仅限于该细胞谱系的消融，尚无诸如MC 特异性基因通路等更直接的证据。除了固有免疫细胞，T 细胞亚群也可以促进CRC的进展。肿瘤被大量产生IL-17 的T 细胞（Th17 细胞）浸润的患者预后不良[28]。

转化生长因子（transforming growth factor，TGF）-β1，IL-6 和IL-23 诱导幼稚T 细胞分化成Th17，这些细胞因子在肿瘤微环境中浓度很高，可诱导T 细胞产生IL-17[29]。IL-17 激活那些能介导炎症反应的基因表达，从而促进肿瘤和血管生长。抑制ApcMin/+ 小鼠（或肠上皮细胞Apc 限制性去除后小鼠）Th17 细胞的功能或阻断其IL-17 功能，或许可以通过防止炎症微环境的建立而减少肠道肿瘤的发生[30-32]。

Th17 细胞不仅产生IL-17，还可产生IL-22，IL-10家族中一种可激活转录因子STAT3 的成员[33]。与IL-17相似，对细菌产物的应答可诱导IL-22，并且在肠内稳态中发挥着重要的作用[34]。有趣的是，IL-22 也由先天淋巴样细胞分泌并在结直肠肿瘤发生发展中起着双重作用。

在结肠炎相关癌（colitis-associatedcancer，CAC）小鼠中，缺乏IL-22 可能会通过影响结肠修复加速炎症，但在恢复期后可促进肿瘤细胞增殖[35]。同样，主要由Th2 细胞产生的IL-4则通过加速结肠肿瘤细胞增殖而促进肿瘤生长。缺乏IL-4 和IL-13受体复合物IL-4Rα 链的小鼠生长的肿瘤更小而且更少[36]。此外，IL-4 和IL-13 增加肿瘤促进性的巨噬细胞分化，有助于肿瘤的形成和发展[37]。相反，细胞毒性T 细胞、记忆性T细胞和Th1 细胞浸润的肿瘤与CRC 患者生存时间延长相关[28]。

Treg 细胞是肠黏膜免疫平衡所必需的。它们主要通过产生抗炎细胞因子IL-10 来抑制获得性免疫，并在一定程度上影响固有免疫。某些癌症患者中，Treg 细胞与较差的预后相关，因为这些细胞抑制抗肿瘤免疫从而使肿瘤逃避免疫应答。令人惊讶的是，对于CRC 患者，肿瘤组织中Treg 细胞的存在是一种很好的预后因素[28,38]。结肠肿瘤的发展伴随着细菌易位，导致一个强大的抗微生物免疫反应，包括Th17细胞的活化。

结肠黏膜中的Treg细胞可以抑制Th17 细胞的反应，从而减少炎症的致瘤作用。Treg 细胞的过继转移可以抑制散在的和因炎症引起的肠道肿瘤的发生，这可能是由于Treg细胞可以抑制炎症反应[39,40]。另一方面，特定细胞因子的存在，可以使Treg 细胞分化为Th17 细胞。Apc△ 468 小鼠息肉中的Treg 细胞可产生IL-17 而非IL-10，并且无法抑制CD4+T细胞[40]。此外，IL-10 激活STAT3，从而上调多种与细胞增殖和生存相关的基因[41]。

鉴于Treg 细胞对不同类型癌症患者有不同的预后价值，以及它们同时具有抑制促瘤炎症和抗肿瘤免疫的能力，更好的了解Treg 细胞在CRC 发病机制中的作用尤为重要。

免疫应答决定了胃黏膜萎缩、肠上皮化生和不典型增生之间的进展，因为Th1 细胞对幽门螺杆菌感染的应答可生产特异性细胞因子。这些细胞因子包括IL-1、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α 和IL-10，可引起慢性炎症，增加肿瘤进展的风险[42]。然而，个别细胞因子的产生可能影响胃癌的易感性。

在感染幽门螺杆菌的过程中，Th1细胞因子IFN-γ 可以促进或抑制炎症诱导的胃癌，表明更为特异的免疫应答介导了肿瘤监视或促肿瘤作用。尽管之前的研究报告称，IFN-γ 可能促进胃癌癌前病变的发展，但最近的研究显示，胃中低水平IFN-γ的过度表达可以预防IL-1β 和猫属幽门螺杆菌依赖的致癌作用[43]。此外，IFN-γ 抑制Th17 细胞的发展。因此，肿瘤微环境中相同细胞和细胞因子的不同组合可促进或抑制致癌作用。

除了癌细胞和浸润的免疫细胞之外，肿瘤的基质环境还包括多种间充质细胞，其中多数为癌相关性成纤维细胞（cancer-associated fibroblasts，CAF）。CAF 与胃肠黏膜的正常肌成纤维细胞十分相似。然而，CAF 的表现不同于正常组织中的肌成纤维细胞和成纤维细胞。根据临床和基础研究，这些基质细胞在胃肠癌的发展和转移中发挥了作用[44,45]。若患者的肿瘤周围结缔组织形成中含有大量的CAF，则其预后较不含结缔组织增生肿瘤患者的预后差[46]。

大量的研究试图确定CAF 的来源，研究局部的成纤维细胞、平滑肌细胞、内皮细胞（通过内皮细胞-间充质转化）、上皮细胞［通过上皮细胞- 间充质转化（epithelial mesenchymal transition，EMT）］、纤维细胞和招募的骨髓来源性细胞如间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC）[47,48]。MSC 是骨髓中一小组具有多向分化潜能的非造血细胞，可被活化招募至炎症和伤口部位[49]。

有研究已对MSC 分化为CAF或肌成纤维细胞进行了分析，很大一部分的CAF 起源于骨髓来源的MSC[44]，并且促进了正常的骨髓MSC 龛及MSC 的自我更新[44]。这些骨髓龛内的细胞扩充呈TGF-β 依赖性，并由CXCR4 和CXCL12信号招募，和MSC 一起作为CAF 到达早期肿瘤周围。

CAF 通过促进肿瘤细胞增殖和浸润有助于肿瘤的形成。CAF 表达大量的致瘤因子，包括IL-11（激活STAT3）、肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF）和成纤维细胞生长因子，这些致瘤因子可激活丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activatedprotein kinase，MAPK）和磷脂酰肌醇3- 激酶[50,51]。

正常情况下，丝氨酸/ 苏氨酸激酶肿瘤进展基因位点-2（tumor progression locus-2，Tp12）可抑制HGF 的释放。将肠肌成纤维细胞中的Tp12 特异性删除可导致基质中HGF 生成的增加，继而使肿瘤细胞中c-Met 的磷酸化和AKT 的激活。与野生型小鼠相比，Tp12 缺陷的小鼠给予氧化偶氮甲烷和硫酸葡聚糖钠诱导CAC 可产生更多更大的肿瘤[52]。

肿瘤微环境中HGF 产生的增加可以通过激活肿瘤细胞c-Met 受体而降低黑色素瘤和结肠癌细胞对Raf 抑制剂的敏感性，这支持了肿瘤微环境是影响治疗应答的一个重要因素的观点[53,54]。肿瘤相关性成纤维细胞不仅通过直接信号刺激结直肠肿瘤的发生，也可以间接地通过募集获得性和固有免疫系统的细胞并使其极化为促肿瘤表型而促进肿瘤发生[55]。

肿瘤血管是GI 肿瘤微环境的另一个重要组成。肿瘤必须形成新的血管以维持供应生长所需的氧气和营养。肿瘤细胞和基质细胞产生若干因子诱导新生血管的生成以使肿瘤组织有足够的灌注[56]。肿瘤血管参与许多不同的促瘤生长的过程。被激活的肿瘤血管内皮细胞可以招募炎症细胞和内皮祖细胞而促进致瘤性炎症和新生血管的形成。此外，肿瘤内皮细胞分泌许多旁分泌因子直接促进肿瘤细胞增殖，保护肿瘤干细胞[57]。肿瘤血管也是肿瘤转移所必需。

新形成的肿瘤血管结构通常是异常的，这增加了肿瘤细胞血管内渗的机会[58]。内皮细胞也能产生一些可招募髓系细胞至转移部位的趋化因子，这有助于在转移部位形成一个不利的微环境[59]。内皮细胞对癌细胞衍生CCL2 的应答所产生的CCR2 信号可改变血管通透性，促进肿瘤细胞外侵至新的组织和转移部位[60]。

神经作为GI 生理学的一个重要组成部分也可能参与恶性肿瘤进程。除了调节GI 运动，神经输入可调节GI上皮细胞的增殖，并有证据表明，神经系统可调节干细胞的更新[61]。有资料表明，神经系统可调节造血干细胞和其壁龛之间的相互作用，而肠上皮干细胞和祖细胞则受黏膜传入神经的控制[61]。癌前病变和肿瘤组织诱导神经形成[62]。然而，神经在正常GI 稳态及癌变过程中的确切作用和功能尚待进一步研究。

浸润细胞激活的信号通路

被招募到GI 部位的免疫细胞的类型和数量，以及它们所产生的细胞因子和生长因子，共同决定了组织环境是否会形成肿瘤（见图2 和表1）。这些因子通过旁分泌、自分泌、近分泌的方式激活汇聚在肿瘤和基质细胞“中枢”的信号通路。有些中央信号转导通路已被广泛研究，而且它们的中心已被确定。

通过对其的全面了解，提出了针对此中枢的靶向治疗，以阻止胃肠肿瘤生长和发展所需的多条通路。相同信号通路不仅参与正常的生物过程和GI 稳态的维护，也参与了GI 癌的形成过程。这些信号包括肠道和干细胞维持自我更新所需的Wnt、Notch、TGF-β和Hedgehog 信号通路；组织修复和免疫自稳所需的核转录因子κB（NF-κB）和STAT3 ；调节对抗肠道菌群的免疫耐受的Toll 样受体（Tolllike receptor，TLR）信号以及提供有丝分裂和生存信号的MAPK 或Akt/PKB 等生长因子信号通路。

NF-κB 调控许多控制生理和细胞过程的基因，如生存、凋亡、免疫以及炎症，但NF-κB 也通过不同的机制促进肿瘤形成[63]。在上皮组织中，炎症通过激活NF-κB，导致促进细胞存活和防止细胞凋亡的基因转录，提高初始上皮细胞的生存率[64,65]。有趣的是，上皮细胞中的NF-κB的组成性激活伴随着由微生物诱导的MAPK 激活只会造成破坏式炎症[66]。此外，肠上皮细胞中NF-κB 的持续激活可以上调诱导型一氧化氮合酶，从而导致DNA 破坏和杂合性缺失并促进转化[67]。NF-κB 可诱导COP9 信号复合体，从而阻断泛素化和随后的转录因子Snail 的降解，造成炎症诱导的EMT[68]。

在髓系细胞中，NF-κB 控制炎性细胞因子的产生，如IL-6、IL-11 和TNF-α。这些细胞因子反过来通过NF-κB 和STAT3 信号激活上皮细胞增殖和生存通路[64,65]。有资料表明，阻断小鼠髓系细胞NF-κB的活性可减少结肠炎相关性肿瘤的数量和大小[64]。

STAT3 调控伤口愈合过程相关基因，并如NF-κB一样可调控上皮细胞生存和增殖。阻断上皮组织中的STAT3 可预防小鼠氧化偶氮甲烷诱发腺瘤的形成，但由于促进细胞存活和防止细胞死亡的基因表达的减少，可造成炎症加剧[69,70]。相反，表达一种突变gp130 链（细胞因子IL-6 型受体的信号转导亚单位）的小鼠，由于增加了IL-11 诱导的STAT3 激活，而自发胃息肉[71,72]。同样，在CAC 的小鼠中，gp130 基因的突变通过IL-6 和IL-11 增加STAT3 的激活，防止由葡聚糖硫酸钠造成的上皮损伤和炎症，但也加速了肿瘤发生[69]。在胃癌细胞中，STAT3 激活TLR2的表达； TRL2 抑制剂可预防胃肿瘤的发生而无法阻止炎症，表明TLR2 在STAT3 致癌功能中的作用[73]。

STAT3 不仅影响上皮细胞增殖和生存，并且控制炎性细胞因子的表达和增加免疫抑制因子的生成，通过激活祖细胞中的STAT3 阻止DC 的成熟[74]。渗透入肿瘤组织的免疫细胞中STAT3 的活化可促进肿瘤的发展。STAT3 可激活TAM 的IL-23 转录，但抑制DC中抗肿瘤细胞因子IL-12 的NF-κB 依赖性表达[75]。由巨噬细胞产生的IL-23激活表达IL-23R 的Treg 细胞中的STAT3，导致免疫抑制细胞因子IL-10 的上调，IL-10 也能激活STAT3，引起免疫逃避。

IL-23 和STAT3 都涉及致瘤性Th17细胞生成和扩增以及IL-17 的产生[31,32]。STAT3和NF-κB 的作用和调控在多个水平上相互关联，它们以旁分泌和细胞自治方式相互调节。非磷酸化STAT3 连同NF-κB，通过介导RelA 乙酰化过程保留细胞核中的NF-κB，促进NF-κB 调节基因的转录[76,77]。有趣的是，STAT3 活化还通过诱导拮抗TGF-β 信号的Smad7 转录来干扰TGF-β信号[71]。

TGF-β 信号在肿瘤的发展中有双重的作用，同时具有促癌和抗癌活性[78]。T 细胞中的TGF-β信号抑制炎症反应也因此阻止肿瘤的形成。含有Smad4 缺乏型T 细胞的转基因小鼠自发GI 肿瘤，增加炎性细胞因子水平，并且有较高浓度的Th17 细胞[79,80]。另一方面，TGF-β 介导的免疫抑制可导致免疫逃避和抗肿瘤免疫减弱。T 细胞中Smad7 过度表达的转基因小鼠往往出现严重的结肠炎，但抗肿瘤免疫增强，较少出现肿瘤[81]。

在其它的基质细胞，如成纤维细胞中，TGF-β 信号同样重要。对TGF-β 失反应的成纤维细胞，导致前胃浸润性鳞状细胞癌的发生，这与HGF 生成的增加以及上皮细胞增殖有关。以上发现提示，在正常条件下，成纤维细胞中的TGF-β 对HGF 有负调节作用[82]。TGF-β 信号除了在免疫细胞中发挥重要作用，TGF-β 信号还可调控上皮细胞的肿瘤进展。

上皮细胞TGF-β 信号的缺失，造成趋化因子增多，并将产MMP iMC 募集至肿瘤边缘，从而促进肿瘤侵袭[83]。然而，有趣的是，血小板衍生的TGF-β，协同激活肿瘤细胞中Smad 和NF-κB 的TGF-β 信号，通过诱导浸润性间充质细胞样表型促进肿瘤转移[84]。

TGF-β 活性的改变影响肿瘤发展，在人的结直肠肿瘤中常发现TGF-β 信号的改变，这与小鼠模型的观测结果一致。许多GI 肿瘤，包括结直肠肿瘤，存在TGF-β 受体（TGF-βreceptor，TGFBR）表达下降或缺失。此外，TGFBRII 或Smad4 的基因突变，以及较少见的Smad2 突变，在人类结肠肿瘤中占相当大的比例[78]。肿瘤的发生发展与组织破坏和细菌易位有关，所以微生物刺激激活的信号转导通路可能参与了GI 肿瘤的发生。在肿瘤微环境中，细菌及其代谢产物是通过模式识别受体（TLR 和Nod 样受体）而被感知。人体区分有用的共生菌和致病菌的能力，很大程度上取决于模式识别受体的功能。

TLR 几乎在肠道的每个细胞中都有表达，并在一些衔接蛋白如MyD88 的帮助下，通过MAPK 和NF-κB 转导信号。这些信号通路的激活导致趋化因子、炎性细胞因子和抗菌肽的产生[85]。通过删除衔接蛋白MyD88，阻断TLR 信号转导，可减少了ApcMin+/- 小鼠的肿瘤数目并减缓肿瘤生长速度[86]。然而，MyD88 缺失型小鼠出现了严重的炎症，同时结肠炎诱导性肿瘤生长加速[87]。这些看似矛盾的数据表明，MyD88 在炎症诱导性肠肿瘤发生和散发性或家族性癌症中起着不同的作用。其中，散发性或家族性肿瘤与炎症关联不大。

在炎症过程中，MyD88 信号可能是有效的组织修复必不可少的因素；MyD 信号的缺失可加速炎症和肿瘤的发生。在散发性或家族性CRC 中，MyD88 则可能通过诱导不恰当的组织修复反应导致肿瘤细胞的增殖和肿瘤生长加速。有趣的是，由炎性小体介导的IL-18 信号中断的小鼠与MyD88 缺失型小鼠在CAC 敏感性方面类似[87]。此外，Nlrp3、Nlrp6、胱天蛋白酶-1 和ASC 等炎性小体组件的缺陷，可降低血清IL-18 的水平和促进炎症相关肿瘤的发生，其表型与IL-18 缺失型小鼠相似[88]。

最近有研究表明，IL-18 是下调IL-22 结合蛋白（IL-22 binding protein，IL22BP）所必需的[35]。IL22BP是一种水溶性、高亲和力的IL-22 受体，在稳态下能限制IL-22的可用性[89]。

然而，在上皮细胞损伤时，IL22BP 下调，允许IL-22 结合至跨膜受体上，诱导组织修复。因此，IL-22 缺乏通过降低IL-18 水平和炎性小体信号的失调，造成更明显的炎症和随后的肿瘤进展加速。

肿瘤微环境是GI干细胞的壁龛

未转化干细胞壁龛的自我平衡取决于它的微环境（图3）。正常肠道干细胞（intestinal stem cell，ISC）位于隐窝底部，依赖于可附着可溶解的基质上皮，并与其相互作用，创建一个壁龛[90]。小鼠基因谱系追踪研究报道了两种不同类型ISC 的标志物。隐窝基底柱状细胞为表达Lgr5 和CD133（Prom-1）[91,92]的快速更新的干细胞。

慢循环细胞，通常在隐窝的+4 位置，特点是高表达的Bmi1和Tert[93,94]。虽然这两种类型的细胞在功能上是相互关联的[95]，但它们确切的层次关系尚未确定。无论其位置（腺窝基底柱状细胞或+4 位置细胞）或功能如何，ISC 均依赖于腺周肌成纤维细胞和邻近分化的上皮细胞等干细胞壁龛细胞的信号[96]。ISC 维护和增殖所需的重要信号通路包括Wnt、Notch、骨形态生成蛋白和Hedgehog 通路[90]。

结直肠癌干细胞（CRC stem cell，CSC）的几种标志物，如CD24、CD44、CD133 和CD166 等相继被发现[97-99]。然而，CSC 的可靠标志物尚未被确定。例如，CD133 在鼠和人的结肠上皮中广泛表达[100]，因此并不能特异性识别是间充质干细胞还是祖细胞。有趣的是，doublecortin样激酶1（doublecortin-like kinase 1，Dclk1）可在潜在肿瘤干细胞中被检测到而非正常干细胞，因此可能是CSC 的有效标志物[101]。虽然结肠CSC 的特异性壁龛尚未确定，但一个维持肿瘤起始细胞的微环境是可能存在的。Wnt 信号是肿瘤启始细胞所需的，最近已识别出ISC（Lgr5+）特异性负反馈调节因子[102]（图3）。

此外，由基质成纤维细胞分泌的HGF 增加肿瘤起始细胞中的Wnt 信号[103]，并且肌成纤维细胞区域（与其它区域相比）更高比例的肿瘤细胞含有核β- 联蛋白[104]。重要的是，TNF-α依赖性NF-κB 的激活可以增加β- 联蛋白信号和干细胞转录物组的转录[105]，导致Lgr5+ 干细胞的扩增[106]。更为重要的是，在有丝分裂后的上皮细胞内，NF-κB 和活化β- 联蛋白的相互作用诱导非干细胞去分化或重组成为肿瘤起始细胞（图3）。

因此，启动肿瘤发生不再是正常干细胞所独有的功能。相反，炎性微环境（如在炎性肠病患者的肠道）可导致正常分化的上皮细胞转化成为CSC。然而，这一理念同样适用于肿瘤形成和治疗，旨在通过消除如Dclk1+ 细胞，消耗CSC[101]。晚期肿瘤的炎性微环境可以使肿瘤细胞去分化成CSC，以补充干细胞的消耗。

炎性微环境和CSC 之间相互作用的其他证据来自Barrett 食管和食管腺癌的转基因小鼠模型[107]。胆汁酸诱导的IL-1β 和IL-6依赖性炎症激活胃- 贲门干细胞的形成，迁移到远端食管，引起食管的柱状上皮化生和不典型增生。这些结果表明，Barrett 食管和食管腺癌可源于胃祖细胞[108]（图3）。因此，除了上调导致CSC DNA 损伤和基因突变的活性氧和氮外，炎性微环境是CSC 壁龛形成和维护所必需的。对这类特殊壁龛的定义和特点的研究将是未来的一项挑战，针对该靶点设计的药物具有广阔的治疗前景。

微生物对肿瘤微环境的作用

人类微生物的成与癌症等疾病密切相关[109]，因此，微生物是肿瘤微环境的另一个重要因素（图4）。动物模型中，某些细菌可引起和促进肠肿瘤的发生。但目前尚不清楚是否存在一种诱导GI 癌症的主要特定细菌，或者是否存在一种有助于其转化的由不同细菌构成的菌群。幽门螺杆菌感染是一个描述胃癌细菌性危险因素的最佳例子。然而，不典型增生和癌症倾向于在幽门螺杆菌定植被大大降低或在某些情况下从胃完全消失时发生。

胃癌几乎总是发生在长期胃萎缩和胃酸过少诱发肠道细菌过度生长的条件下。虽然根除幽门螺杆菌的抗生素治疗方案延迟和抑制小鼠胃癌的发展[110]，但抗生素不仅根除了幽门螺杆菌，也根除了定植在萎缩、胃酸分泌过少的胃黏膜上的其它微生物。与有一般菌群定植的幽门螺杆菌感染INS-GAS 小鼠相比较，幽门螺杆菌感染的无菌INS-GAS小鼠胃癌的发生延迟[111]。因此，幽门螺杆菌可能是最初始、或最普遍的促进胃癌发展的微生物因素。

描述与CRC 相关的细菌的特征是很重要的，这可能有助于确定CRC 风险升高的个体和研发新的治疗方法。然而，要准确识别与CRC 相关的特定细菌可能需要更敏感的技术和更大型的队列研究。此外，CRC 相关的微生物组成可能随着肿瘤进展而变化，因此也应该考虑CRC相关微生物在肿瘤不同分期中的情况。

最近的一项分子特征频率［CpG 岛甲基化表型（CpG island methylator phenotype，CIMP-high），微卫星不稳性（microsatellite instability，MSI-high）和BRAF 基因突变］研究显示，根据连续性模型直肠到升结肠的连续性增加[112]，表明从近端结肠到远端结肠存在一个连续的菌群变化。随着高通量测序技术的出现，全面映射与人类CRC相关的内生态失调性已变成可能。研究发现，CRC 患者的菌群组成存在着相当大的变化，并且不同的细菌趋向于在肿瘤组织或其邻近的健康黏膜定植。其中最突出的发现是缩杆菌属与CRC 组织相关[113]。

有趣的是，机会致病菌都属肠杆菌科，如志贺氏杆菌、沙门氏菌、克罗诺斯氏菌和柠檬酸细菌属，这些致病菌都聚集在肿瘤旁正常组织而非肿瘤组织中[113]。与健康对照组相比，CRC 患者肠道微生物中致病菌含量更高，这与上述结果一致。相反，罗氏菌属和毛螺菌科产丁酸细菌在CRC 患者肠道微生物中所占比例较低[114]。

确定这些细菌是如何引发或影响肿瘤发生仍然是未来研究的一个重要课题（图5）。一些结肠细菌的促瘤特性涉及细菌毒素的释放，在多发性肠瘤小鼠中，细菌毒素通过Th17细胞介导的反应诱发结肠炎和结肠肿瘤的形成[31]。还有一种替代机制包括特定的遗传毒性菌株的传播[115]。在IL-10 缺失型小鼠中，炎症通过其对小鼠和菌群的影响创建一个支持肿瘤发生的环境。这个环境可促进含有聚酮合成酶（polyketide synthase，pks）基因组岛的大肠杆菌的扩增，而pks 基因组岛可编码细菌遗传毒素colibactin[116]。这些大肠杆菌黏附至结肠黏膜，造成pks产生增加，最终导致上皮细胞DNA 的损伤[115]。

重要的是，除了对肠上皮细胞直接的遗传毒性作用，肠道屏障的缺陷可能导致非致病菌的易位，通过改变促肿瘤免疫反应的平衡而破坏肠道免疫系统稳态。细菌产物通过TLR 和Nod 样受体等模式识别受体被感受。这些信号通路的激活可产生趋化因子、炎性细胞因子和抗菌肽[85]。Wnt 信号激活可诱导屏障缺陷，造成紧密连接蛋白的异常表达和错误定位，包括闭合蛋白和上皮细胞的多种密封蛋白，同时下调保护粘蛋白的表达。

在肿瘤发生的早期阶段，细菌的入侵诱发复杂的炎性反应，上调IL-17和IL-23，从而促进肿瘤的发展[32]，这一过程与菌群的构成无关。在肿瘤的后期，突变的上皮细胞p53 功能丧失，加剧这一屏障缺陷并进一步放大了炎性微环境，肿瘤上皮和髓系细胞上的NF-κB 和STAT3 随之活化。上皮细胞和髓系细胞中这些信号通路的共同激活促进p53 缺陷肿瘤细胞的EMT 发展，这也是肿瘤侵袭和转移所必需的[117]。

治疗展望

大量的证据表明肿瘤微环境及其细胞、细胞因子和趋化因子所构成的复杂网络在肿瘤形成、发展和转移中的重要性。不同的细胞类型和信号通路在干细胞生物学、肿瘤恶性转移和微生物方面有重要的影响。

为了拓展胃肠道肿瘤治疗新理念，有必要更好地了解基质细胞与上皮细胞之间的相互作用，该网络中特定信号对于肿瘤发生的促进或抑制作用等。首要目标是明确有助于诱发炎性促瘤环境建立的因素（细胞因子、趋化因子和细菌），干扰这些因素可能使癌细胞对直接细胞毒治疗更敏感。尽管现有的一些治疗方法已经非特异性地作用于某些基质成分，但仍然需要在基质特异性疗法上取得重大的进展。

图3 肿瘤发生的潜在机制。

（A）正常的肠干细胞壁龛包括被间充质细胞和基质所包围的上皮干细胞。不同的信号分子通过严格的调节梯度区分干细胞区、增殖区和分化区。上皮细胞被定期更新的干细胞和祖细胞取代。肠道肿瘤的发生有三种不同机制。

（B）肿瘤的发生通过干细胞区隐窝底部的干细胞和祖细胞的扩增完成。慢性炎症和各种间充质和免疫细胞的招募引起的信号网络失调，而使增殖区扩增，为源自组织干细胞的肿瘤起始细胞提供了一个壁龛。

（C）隐窝/ 绒毛顶端已分化上皮细胞的去分化是由慢性炎症、NF-κB 的上调和β- 联蛋白或K-ras 的遗传突变诱导的。基因突变导致正常的肠上皮细胞被重组成组织干细胞，获得增殖的能力并逃避细胞凋亡。

（D）在贲门和食管，干细胞向炎性壁龛的迁移促进干细胞的增殖，出现基因改变，并在炎性壁龛中逃避细胞凋亡。

图4 肠道菌群失调可由以下因素诱导：（1）先天遗传性或后天获得性上皮突变造成上皮屏障缺陷和上皮细胞功能的损害；（2）外部因素如饮食的变化、有毒物质和环境条件，都会影响微生物及某一类型细菌的选择；（3）慢性炎症诱导屏障缺陷及特定微生物选择的炎性反应。

考虑到GI 肿瘤与炎性条件的强关联性，以及炎症对肿瘤发展的重大影响，阿司匹林和其它非甾体抗炎药用于预防和治疗是合理的[4,118]。患者被确诊罹患癌症后服用阿司匹林是否会影响其生存，取决于肿瘤细胞是否存在PIK3CA的突变[119]。考虑大肠癌的连续统假说[112] 中提到的肠道生物分布的逐渐过渡特性，阿司匹林对于不同部位或不同分子特征的肿瘤的作用也可能不同。然而关于阿司匹林诱发炎症反应的变化可以判定患者的预后以及特定癌细胞突变的发现表明，设计以肿瘤微环境为靶点的制剂是可行的。

抗血管生成疗法如贝伐单抗［抗血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）单克隆抗体］是一种经证实有效的抗基质治疗方法，但缺乏真正的治疗获益。

针对VEGF 和内皮生长因子抗体尚未被引入到辅助治疗中[120]，贝伐单抗因曾被观察到对转移性CRC 患者有生存益处[121] 而被FDA批准。抗血管生成药物似乎可减缓肿瘤的生长和进展，但不能阻止新的转移灶形成；这可能是由于血流量、缺氧与肿瘤生长之间的复杂关系所导致的。治疗或预防癌症转移或复发可能需要针对肿瘤微环境或干细胞壁龛的其它因素。例如，Dnmt1 抑制剂地西他滨和非甾体抗炎药已被认为对基质有治疗作用。

有研究发现，叶酸是炎性胃癌小鼠模型的一种化学预防剂，它通过影响CAF 的DNA 甲基化和生物学效应发挥作用[122]，与作用于人类CRC 的机理一样。然而，表观遗传修饰也影响上皮细胞，因此很难把其防癌作用完全归于基质。以上药物潜在的副作用也限制了其在临床的应用。

一些已经在临床应用的治疗药物可以提高抗肿瘤免疫应答，削弱肿瘤诱导的免疫抑制。舒尼替尼是一个多靶点的酪氨酸激酶受体抑制剂，其联合免疫治疗可降低MDSC和Treg 细胞的数量，增加肿瘤特异性T 细胞在瘤内的浸润，缩小肿瘤体积和延长荷瘤小鼠存活时间[123]。此外，大多数治疗的总目标是防止转移。分析CRC 细胞中的信号事件可以识别最有可能发生转移的肿瘤。具体而言，无论是原发灶还是转移灶，肿瘤基质TGF-β 的表达均与转移潜能有关。这一发现引发了一个矛盾，即在肿瘤中有高水平的TGF-β，但也有突变失活的TGF-β。因此，抑制TGF-β可能预防CRC的转移[124]。

以肿瘤微环境中其他的特定蛋白或细胞类型为治疗靶点也是有可能的。成纤维细胞活化蛋白专一表达于大多数人类上皮癌的肿瘤相关成纤维细胞和周细胞，通过基因或药物治疗中断或抑制成纤维细胞活化蛋白可抑制和降低小鼠皮下移植瘤的生长和肿瘤细胞增殖[125]。然而，这种方法很可能产生副作用，因为这些细胞中几乎不存在特异性的标志物。因此有必要在肿瘤微环境中找到一些新的靶点。

图5 肠道菌群在肿瘤发生中的作用。在正常的肠道内，细菌与上皮细胞之间的相互作用，由黏液层和功能性紧密连接蛋白保护，可维持必要的平衡。在癌症的初始形成中，内生态失调和/ 或屏障缺陷使得微环境有助于DNA 损伤、基因改变和促瘤信号网络。

在内生态失调的情况下，一些肠道细菌释放能影响上皮细胞屏障功能的毒素（减少黏液层，紧密连接蛋白的缺陷），也可能诱导基因改变。这可诱发炎症及促进基质细菌的迁移，导致更多的炎性细胞招募，最终形成一个致瘤性环境导致肿瘤发生。屏障缺陷也可以由先天遗传或后天获得性的基因改变引起，造成上皮功能损害和内生态失调。可能引发炎性状态，导致肿瘤微环境形成的上皮屏障缺陷包含2 种通路，二者可以独立或协同作用。

宿主免疫系统对治疗结果和治疗反应的影响引出了免疫评分的想法，该评分被（国际专家组）纳入癌症患者的常规诊断和预后评估[12]。目标是描述不同免疫细胞（包括T 细胞）和其他间充质细胞的特征，分析其与预后和治疗应答的相关性，并与TNM 分期相结合。这种免疫评分对GI 癌患者的预后价值和可行性，仍需进一步验证。然而，宿主的免疫应答及淋巴结数量的增加，均与患者预后相关。有必要全面评估患者的免疫应答、疾病分期、淋巴结数目以及肿瘤分子特征以做出完整的评价[126]。

改进对肠息肉、胃肠上皮化生或者Barrett 食管患者的监测，将有助于确定细菌在肿瘤形成和癌前病变进展中的重要性。尚不清楚为何只有一小部分炎症性疾病，如Barrett 食管或幽门螺杆菌感染患者最终发展为食管腺癌或胃癌。提高对微生物的认识可以提供全新的GI 炎症和肿瘤治疗策略。

在研发特异性针对CSC 的化疗药物上已作出了巨大的努力。在这方面，CSC 标志物成药激酶Dclk1 的发现，可能会使我们找到在不影响正常组织干细胞情况下预防肿瘤形成和发展的途径[101]。有待确认的是仅针对CSC 的药物是否足以抑制肿瘤复发或转移，或CSC 是否从正常干细胞转化而来。因此制定相关策略以干扰对于维持正常干细胞和CSC 稳态有重要作用的基质通路尤为重要，如Wnt、Notch 和Hedgehog 通路[127]。

这样可诱导终末分化，剥夺CSC 自我更新的能力或抑制去分化。我们可能会发现很多新的方法来改变肿瘤赖以生长的肿瘤微环境和炎症环境。今后应该优先将积累的关于肿瘤微环境的知识转化成临床试验，例如把肿瘤基质靶向治疗的药物与传统的化疗药物相结合。

转自：海峡消化（中国中医科学院西苑医院许云翻译唐旭东审校）